Tamanho da fonte: 

A colibacilose está relacionada com grandes prejuízos na avicultura industrial e a Escherichia coli patogênica das Aves (APEC) é o agente etiológico desta enfermidade. A identificação deste patógeno é dificultada pela presença de cepas comensais na microflora intestinal (AFEC - Avian Fecal Escherichia coli). Atualmente já é conhecido que APECs diferem dos AFECs por carregarem um grande conjunto de fatores de virulência (FV) majoritariamente localizados em plasmídeos. Atualmente a diferenciação destas cepas é baseada na detecção dos FVs plasmidiais iroN, iss, iutA, hlyF e ompT pela reação em cadeia da polimerase (PCR). Nosso grupo tem trabalhado no desenvolvimento de uma metodologia mais prática e rápida para detecção dos mesmos FVs pela PCR em tempo real. Até o momento, obteve-se êxito no acerto dos alvos hlyF, ompT e iroN que apresentaram 100% de concordância de resultados com a PCR convencional (padrão ouro). Observou-se, porém, que a amplificação conjunta dos alvos iutA e iss apresentou uma concordância mais reduzida, devido a resultados falsos positivos gerados pelo iss. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo melhorar a eficiência do teste, através da utilização de 2 novas combinações de iniciadores para detecção de iss testadas conjuntamente com iutA. A primeira combinação de iniciadores consistiu de sequências presentes na região interna do gene iss, e a segunda uma sequência interna ao iss e outra que se localiza numa região adjacente ao gene (sequência plasmidial). Após otimização das reações, foram analisadas 111 amostras de E. coli (61 APECs e 50 AFECs), onde foram realizadas amplificações pela PCR convencional e as 2 novas combinações com a PCR em tempo real. O alvo iutA apresentou os mesmos resultados nas 2 combinações na PCR em tempo real. Quando comparadas com a PCR convencional, obteve-se especificidade (100%), sensibilidade (98,3%), concordância (99,1%) e Kappa de 0,98, indicando estar adequado para a tipificação de APECs. O teste de X² demonstrou que a comparação da combinação iss 1 com a PCR convencional apresentou diferenças significativas (p <0,05), enquanto a segunda combinação apresentou melhores resultados, sem diferenças significativas. Comparando os resultados das combinações 1 e 2 com o teste padrão, respectivamente verificou-se um aumento de especificidade de 66,7 para 100%, concordância de 84,7 para 99,1% e índice Kappa de 0,68 para 0,98. Verificou-se uma pequena redução na sensibilidade (de 100 para 98,3%), que não alterou a identificação do patotipos estudados. A estratégia da combinação 2, que inclui um iniciador no gene iss e outra na região plasmídial adjacente ao gene foi utilizado também no desenho dos iniciadores deste alvo na PCR convencional. Para tipificação conjunta dos 5 FVs utilizando a nova combinação de iniciadores, verificou-se completa concordância de resultados, demonstrando que a nova técnica é adequada para diferenciação de APECs de AFECs.