O vírus da diarreia viral bovina (BVDV, bovine viral diarrhea virus) é o agente etiológico de patologias sistêmicas em bovinos que são responsáveis por importantes perdas econômicas na pecuária mundial. Dados epidemiológicos demonstram que o BVDV está presente nos rebanhos do nosso estado com uma prevalência de animais portadores de anticorpos entre 23,4 e 58,8%. Taxonomicamente o BVDV pertence à família Flaviviridae, gênero Pestivirus e pode ser classificado em 3 genótipos: BVDV-1, BVDV-2 e BVDV-3. A partícula viral é envelopada, possui simetria icosaédrica e o material genético é constituído de uma única fita de RNA com orientação positiva. O diagnóstico da diarreia viral bovina é geralmente realizado com base na presença de achados clínicos e patológicos característicos, mas a suspeita clínica deve ser confirmada com análises laboratoriais de isolamento e/ou detecção do RNA viral. Recentemente, a detecção molecular pela técnica de transcrição reversa – reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) tem sido mais utilizada devido à rapidez e maior facilidade de realização em uma rotina de análise. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma técnica com duas etapas de amplificação (RT-nPCR) para aumentar a sensibilidade e especificidade na detecção do BVDV em relação à técnica de RT-PCR tradicional. A metodologia consistiu em duas etapas: (1) desenho da técnica de amplificação e (2) validação do procedimento analítico completo. No desenho da técnica foram selecionados 4 iniciadores (primers) localizados na região 5´ não traduzida e gene N-pro, correspondente a porção inicial do genoma do BVDV, com base na pesquisa em artigos científicos (Vilcek S, 1994;39(11):687-700; Givens et al Vet. Microbiol. 96, 145-155). A técnica de amplificação foi estabelecida com uma primeira amplificação utilizando o par de primers externos BVD100F / BVD326R e a segunda amplificação com o par de primers internos BVDV324F / HCV 368, resultando em um fragmento de 282 bp.  O procedimento foi então implementado no laboratório, sendo realizadas análises de uma cultura viral e de amostras clínicas animais (soro de touros de gado de corte). A avaliação de cultura pura e diluições destas possibilitou verificar detecção até diluição de 10^-5, apresentando uma sensibilidade analítica 10 vezes superior do que a RT-PCR (detecção até diluição de 10^-4). A detecção do vírus em 78 pools de 5 amostras (obtidos a partir de 390 amostras de soro de touros de diferentes estabelecimentos agropecuários) demonstraram a detecção do BVDV em 16 pools previamente negativos pela técnica de RT-PCR. Com base nesses dados concluímos que a técnica RT-nPCR mostrou-se mais sensível do que a RT-PCR na detecção do vírus. Novos estudos estão sendo realizados para uma avaliação mais detalhada do desempenho analítico do procedimento.